עבודת גמר בביולוגיה
נושא העבודה:
בוצע במסגרת תכנית "אלפא" באוניברסיטת תל אביב
תוכן עניינים
תקציר 3
מבוא 3
שאלות המחקר 4
השערת מחקר 4
סקירת ספרות 5
המחלה סוכרת 5
סוכרת מסוג 1 כמחלה אוטואימונית 5
אינסולין 6
נוגדנים כנגד אינסולין 8
תאי B ותרומתם בהתפתחותה של המחלה 9
נוגדנים 9
סיכום 12
שיטות וחומרים 12
כלים וחומרים 12
טבלה מספר 1: טבלת חומרים 12
טבלה מספר 2: טבלת מכשירים 14
שיטות 15
העמדת סטרטרים 15
מיצוי הDNA מהחיידק 15
טרנספקציה לתאי Expi293 15
Western blot 16
ניקוי חלבון על קולונת MabSelect 17
ELISA 18
תוצאות 19
בחינת ביטוי החלבון 19
ניקוי חלבון על גבי קולונת אפיניות MabSelect ובדיקת האלוציות בג'ל 20
בחינת קישור החלבון לנוגדנים כנגד אינסולין 23
דיון 25
ביביליוגרפיה 27
תקציר
סוכרת מסוג 1 זוהי מחלה אוטואימונית שמאופיינת בהרס עצמי של תאי הבטא בלבלב שתפקידם לייצר אינסולין. ההרס נעשה על ידי נוגדנים עצמיים, וביניהם נוגדנים כנגד אינסולין, שבהם נתמקד במחקר זה. מחקרים רבים מראים כי נוגדנים אלו נמצאים בדם גם בשנים שלפני התפרצות המחלה, ואף משמשים כסימן מנבא להתפתחות המחלה. מטרת המחקר היא להפיק את החלבון Proinsulin Fc fusion, לבחון את ביטויו, וכן לבדוק ולכמת את הקישור של חלבון זה על ידי נוגדנים כנגד אינסולין. לשם כך, העמדנו סטרטרים- תרביות חיידקים המכילים את הפלסמיד הרצוי, אשר עבר שיבוטים על מנת שיבטא את הגן לייצור החלבון. לאחר גידול החיידקים בודדנו את הפלסמיד על ידי מיצוי DNA. עם הפלסמיד המבודד ביצענו טרנספקציה לתאי Expi293, בכדי שהתאים יבטאו את החלבון שלנו ויפרישו אותו את המדיום החוץ תאי. לאחר מכן, בדקנו האם החלבון שלנו אכן קיים ומבוטא בתוך המדיום החוץ תאי, ולאחר שקיבלנו תשובה חיובית, נרצה לבחון אותו ולבצע עליו בדיקות שונות. לשם מטרה זו, הפרדנו את החלבון שלנו משאר החלבונים וביצענו ניקוי על קולונת אפיניות Mabselect. לבסוף, בעזרת ELISA כימתנו את הקישור בין החלבון שהפקנו לבין נוגדנים כנגד אינסולין. הממצאים העיקריים שעלו מן המחקר הם שהפקת החלבון צלחה והחלבון אכן מבוטא ומבודד, וכן, מצאנו כי החלבון מזוהה על ידי נוגדנים כנגד אינסולין, וכי יש קישור של החלבון לנוגדן. כמו כן, ראינו כי עוצמת הקישור גבוהה יותר ככל שריכוז הנוגדן גבוה יותר. מחקר זה ותוצאותיו משמעותיים מאוד, וכן תורם למחקר ולפיתוח טיפול במחלה אשר מתבסס על החלבון שהפקנו ועל מחקר זה.
הסוכרת היא מחלה המאופיינת ברמות גבוהות של סוכר בדם, ללא תלות בצריכת מזון. התחלואה בסוכרת מתחלקת לשניים, סוכרת מסוג 1 וסוכרת מסוג 2. סוכרת מסוג 1 היא מחלה שבה מתרחש הרס של תאי הבטא בלבלב (התאים אשר מפרישים אינסולין), על ידי מערכת החיסון עצמה. לאורך השנים הסתמן כי תהליך הרס תאי הבטא נעשה באמצעות נוגדנים עצמיים שהגוף מפתח, שכן סוכרת מסוג 1 מוגדרת כמחלה אוטואימונית. תהליך ההרס של התאים הללו הוא ממושך ונפרש לאורך שנים, מבלי שיופיע סימן חיצוני או סימפטום כלשהו. למעשה, הביטוי הראשון להפרעות ולכשלים המטבוליים שנוצרים בזמן תהליך ההרס, הוא אי סבילות לגלוקוז, וכן סימפטומים של היפרגליקמיה.
כלומר, קיימת סבירות גבוהה שהמחלה תתגלה רק לאחר התפרצות המחלה ממש. אולם, מחקרים רבים בספרות מצביעים על כך שסוכרת מסוג 1 ניתנת לחיזוי שנים לפני התפרצותה, וזאת כמובן באמצעות הופעת כמות גדולה יחסית של הנוגדנים העצמיים השותפים להתפתחות סוכרת מסוג 1. בין הנוגדנים הללו נמצאים נוגדנים כנגד אינסולין, אשר מופיעים גם הם בין השלבים הראשוניים ביותר בהתפתחות המחלה. אינסולין ופרואינסולין (הפרקורסור של האינסולין), הם אנטיגנים עצמיים הידועים כאלו היחידים אשר ספיציפיים לתאי הבטא. במחקר זה נתמקד בנוגדנים כנגד אינסולין.
ההנחה הרווחת כיום, היא שההרס האוטואימוני של תאי הבטא, הוא תהליך המתווך על ידי תאי T. יחד עם זאת, מחקרים רבים מראים כי תאי ה B נוטלים חלק ניכר וחשוב בהתפתחות המחלה. שכן, תאי B מייצרים את הנוגדנים העצמיים המאפיינים את המחלה. כמו כן תאי B מבטאים על גבי הממברנה שלהם קולטנים (BCR), באופן זהה לביטוי הנוגדנים המיוצרים בתאי ה B. משמע, בסוכרת מסוג 1 ישנם תאי B המציגים את הנוגדן על גבי ממברנת התא כנגד אינסולין.
במחקר זה נחקור את הקישור של נוגדנים כנגד אינסולין ותאי B המייצרים אותם בסוכרת מסוג 1 על ידי פרואינסולין מצומד ל Fc עכברי.
שאלות המחקר
כיצד ניתן בעזרת חלבון פרואינסולין מצומד ל-FC עכברי לחסום נוגדנים כנגד אינסולין המופיעים בסוכרת מסוג 1?
משתנה תלוי: חלבון מצומד לFc של נוגדן.
משתנה בלתי תלוי: נוגדנים כנגד אינסולין.
השערת מחקר
אני משערת כי אכן יימצא ביטוי חלבון הפרואינסולין המצומד ל Fc עכברי, וכן תהליך הניקוי יצלח. השערה זו מבוססת על צימוד החלבון ל Fc והיתרונות שאנו מפיקים ממנו, ביניהם ביטוי טוב יותר של החלבון, הקלה על ניקוי ובידוד החלבון, ויכולתם לקשור חלבון A (ובכך לשפר את כושר הייצור). כלומר, מה שיאפשר את ביטוי וניקוי החלבון, הוא הצימוד לFc. כמו כן, אני משערת שקשירת חלבון הפרואינסולין המצומד ל Fc עכברי לנוגדנים כנגד אינסולין ותאי B המייצרים אותם תצליח, מכמה סיבות. תחילה, השימוש בפרואינסולין ולא באינסולין במחקר זה, הוא תלוי גם במבנה החלבון. הפרואינסולין הוא למעשה הפרקורסור של האינסולין. את הפרואינסולין ניתן לבטא כחלבון רציף, ולעומתו האינסולין, עובר ביקוע של ה c peptide, כלומר הפרואינסולין מכיל חלק נוסף שאינו נמצא באינסולין, דבר זה מאפשר גם זיהוי שלו בדומה לאינסולין ולכן אמור להיות מזוהה על ידי רוב הנוגדנים כנגד אינסולין.
יתרה מזאת, כידוע, הFc אחראי על זמן מחצית החיים, ומשום כך הצימוד ל Fc מאפשר לנו את יציבותו של החלבון לאורך זמן. יתרון נוסף אשר מעניק לנו ה Fc fusion הוא יכולת הקשירה של ה Fc לקולטנים ייחודיים על פני התאים, לטובת גיוס תאי החיסון כנגד נוגדן המטרה, ובמקרה שלנו כנגד נוגדני האנטי אינסולין המופיעים בסוכרת מסוג 1 ותאים המבטאים אותם. דבר זה מאפשר, נוסף על היכולת לקשור נוגדני אנטי אינסולין, לגרום להרג או לעיכוב שלהם. יש לציין שעיכוב במקום הרג הנוגדנים והתאים, יתבצע מעצם הקשירה שלהם את הפרואינסולין במקום אינסולין, ולא בגלל ה Fc. מכאן ניתן להגיע להשערה שעוצמת הקישור הנבדק תהיה גבוהה.
אתר סמינריון מהווה פלטפורמה למכירה ולקנייה של עבודות אקדמיות איכותיות בין סטודנטים. באתר תוכלו למצוא עבודות אקדמיות במגוון תחומים ובמגוון סוגים החל מתרגילים דרך סמינריונים ועד עבודות תזה. באתר תוכלו למכור את העבודות שלכם לסטודנטים אחרים ולהרוויח עליהן כסף.
